1
00:00:13,320 --> 00:00:19,029
广泛使用的用于生产和纯化蛋白质的快速程序涉及添加

2
00:00:19,029 --> 00:00:25,430
在此过程中，将肽标签与目标蛋白结合，将编码的DNA片段

3
00:00:25,430 --> 00:00:32,500
目的蛋白将插入具有许多关键特征质粒的质粒中

4
00:00:32,500 --> 00:00:37,910
包含复制起点，可让质粒在宿主大肠杆菌中复制

5
00:00:37,910 --> 00:00:44,720
细胞中还含有赋予对阿拉伯IRA抵抗力的基因

6
00:00:44,720 --> 00:00:49,899
携带质粒或多个克隆位点的细胞的选择提供了许多

7
00:00:49,899 --> 00:00:57,100
限制性内切酶的位点切割PDU上的质粒Williams以消化质粒

8
00:00:57,100 --> 00:01:03,420
例如，它会产生带有蛋白质编码区的DNA的血液末端

9
00:01:03,420 --> 00:01:12,540
也可将其掺混入本实施例的上游质粒中

10
00:01:12,540 --> 00:01:18,840
插入的DNA是三个片段，它们保留了来自多个克隆位点的CAG代码

11
00:01:18,840 --> 00:01:25,920
氨基酸谷氨酰胺最多击中6次即可赎回代码，以将肽标签称为上游

12
00:01:25,920 --> 00:01:33,890
还有另外两个密码子，其中一个是翻译起始位点ATG，它需要甲硫氨酸

13
00:01:33,890 --> 00:01:39,400
较亮的一面是由于缺少：控制何时表达标签蛋白

14
00:01:39,400 --> 00:01:46,380
细胞中的阻遏蛋白与蛋白质结合并形成RNA聚合酶的阻塞物

15
00:01:46,380 --> 00:01:51,829
将一种诱导剂添加到培养基中，最终用户将其与阻遏蛋白结合

16
00:01:51,829 --> 00:02:05,430
并允许RNA聚合酶通过并将DNA转录成RNA另一个重要

17
00:02:05,430 --> 00:02:11,720
工程质粒中的区域是核糖体结合位点，核糖体结合到RNA的RNA上。

18
00:02:11,720 --> 00:02:18,200
在找到第一个AUG起始密码子并将RNA转化为蛋白质之前，先将该位点定位

19
00:02:18,200 --> 00:02:25,740
核糖体继续翻译，直到细胞转化为终止密码子为止

20
00:02:25,740 --> 00:02:32,709
还原表达标签蛋白的质粒标签蛋白结合在细胞中

21
00:02:32,709 --> 00:02:39,110
高达30％的细胞蛋白，其中许多此类细胞在培养物中大量生长

22
00:02:39,110 --> 00:02:45,519
标签蛋白可以被生产下一步是收获细胞，将它们打破

23
00:02:45,519 --> 00:02:51,640
并准备一个粗细胞提取物的柱子，该柱子包括所有与

24
00:02:51,640 --> 00:02:57,079
很少的附加组件可以将标签蛋白与其中的其余细胞材料分离

25
00:02:57,079 --> 00:03:03,019
蛋白质标签中的色谱柱历史对含镍镍具有亲和力并与之结合

26
00:03:03,019 --> 00:03:13,169
所有的珠子都是蛋白质，像标签一样不粘手，可以洗掉

27
00:03:13,169 --> 00:03:18,840
汽车的历史与完整蛋白质的分离是通过一个过程

28
00:03:18,840 --> 00:03:26,600
通常称为亲和纯化返回的蛋白质从低pH的色谱柱中逸出

29
00:03:26,600 --> 00:03:32,220
溶液导致病史残留物成为所需的蛋白质，并且无法与颈部结合

30
00:03:32,220 --> 00:03:38,859
或在小珠上，或者用带有咪唑分子的溶液

31
00:03:38,859 --> 00:03:46,699
在每种情况下，他的团队都会对北约进行绑定，标签蛋白在

32
00:03:46,699 --> 00:03:51,739
标签蛋白从色谱柱中漏出，添加了酶以从

33
00:03:51,739 --> 00:03:57,359
蛋白质的氨基末端同时添加另一种酶以修饰

34
00:03:57,359 --> 00:04:02,770
标签末端的谷氨酰胺残基，这种修饰可防止

35
00:04:02,770 --> 00:04:08,380
在他的研究中设计出了系统中使用的感兴趣的蛋白质，酶

36
00:04:08,380 --> 00:04:15,040
在标签的作用中，标签可让您将酶保留在镍基上，而

37
00:04:15,040 --> 00:04:21,070
感兴趣的蛋白质最终通过另一种酶洗涤，从而去除了修饰的谷氨酰胺

38
00:04:21,070 --> 00:04:27,229
氨基酸，此酶可以稍后通过使用标签中的历史记录从混合物中去除

39
00:04:27,229 --> 00:04:32,940
和镍基，将酶与目标蛋白分离，涉及的步骤

40
00:04:32,940 --> 00:04:37,930
在生产和纯化目标蛋白质时可以相对较快地完成

41
00:04:37,930 --> 00:04:39,229
在一个星期内