大家好
我是来自美国俄勒冈州波特兰的乔纳森·林德纳
我很高兴参与这次会议
我向我在中国的朋友们问好
尤其是品同，祝贺你们成功举办这次会议
尽管由于当前的疫情，使我们不得不保持社交距离
我今天要讲的题目是一下增加组织血流灌注的治疗性空化
超声波对组织的影响会产生许多不同的生物学效应
它们包括热效应
组织空化产生冲击波
但是也有空化是由于暴露在超声造影剂中而产生的 这些造影剂会经历没有破坏情况下振荡的稳定空化或者惯性空化
惯性空化是一种更高能量的事件 伴随着微泡破坏
不论是微泡破坏引起的空化或是没有微泡存在下的高强度超声，都可以在组织中产生大量的对流运动和剪切力
现在
这些生物效应都可以被各种类型的治疗干预所引入
如果我们只考虑空化
空化已经被认为是一种增强溶栓的方法叫做声溶栓，有一些相关的临床试验正在进行
另外空化也可用于组织或肿瘤的消融以及基因和药物传递
我们今天会讲到
主要是空化增加灌注的能力
几十年来 人们都知道
不使用微泡的高强度连续超声可以增加组织血管的扩张
现在这些数据
它们是六七年前在我们的实验室里产生的
这里比较了微泡空化和超声波单独作用的效果的差异
这些是用对比超声灌注成像对小鼠后肢做的实验
肌床内高强度超声及微泡照射前以及十分钟后的超灌注图像
从这些实验数据中
如果我们只观察超声测量的血流信号
在只有超声而没有微泡的条件下
与图中黑色的柱子相比 浅灰色的柱子图说明超声本身就有增加血流的作用
但使用高机械指数1.3时
微泡的间歇性作用十分钟产生的惯性空化
导致肌肉的血液流量增加了7到9倍
正如你在这里看到的
这是关于空化能增加多少血流量的第一个描述
这应该不会让你们感到惊讶
基于空化的生物效应
这些是根据数学模型建立的
也可以由成像成像观察到
根据这幅图像
（稍等）
这是一张间隔显微镜下的图像
你可以看到微泡空化过程中体积有很大幅度的变化
这就造成了血管的扭曲和变化的剪切力
正因为如此
我们最近成像了高剪切力条件下钙内流变化的情况
这里我们观察内皮细胞的改变
这张图中显示的是一条动脉
在这条动脉旁边有三个微泡
正有一个空化事件发生
这是一种特殊类型的老鼠，它通过GCaMP8报告细胞间钙离子，
你可以在这里看到
单个微泡就可以通过降低血管张力来产生长时间的组织血流量增加
当我们研究血管张力时
这些都是决定血管阻力的不同因素
在血管的扩张和收缩之间存在一种动态平衡
这个列表的上部
显示的是引起血管扩张的因素
我们相信
可通过微泡的空化而实现
这些都是我们研究微泡空化是如何增加血流灌注的相关化合物
现在我不会给你们展示没有发挥作用的方面
但我想要给大家看一下是我们研究发现的可以导致血流增加的证据
我们发现最重要的是ATP的释放
这是我们用来检测体内ATP产生的一种方法
这是我们在小鼠身上得到的
小鼠在活体状态切被麻醉了
我们给静脉团注微泡
并在腿部施加间歇性的高机械指数超声
你可以看到腿部局部ATP释放的明显增加，这在对侧腿部是看不到。当我们观察ATP来自培养的上皮细胞的地方时
当我们观察这些ATP是从哪里产生的，是内皮细胞
还是红细胞
或者两者都有
从结果看大部分ATP不仅来自内皮细胞
也来自同样承受剪切力的红细胞
ATP是一种剪切力依赖的血管扩张因素
可以降低血管张力，并通过微血管床向下影响到远端微血管
接下来我们要问为什么ATP会因为空化而产生
显然
当细胞暴露于超声微泡产生的空化效应中时，
可以在生物的内皮细胞中制造小孔
这些小孔会在大约十分钟后恢复
这可以由细胞空化试验来观察得到的
看起来有些ATP的释放是通过在内皮细胞中戳出非常小的洞来实现的，
如图所示
红细胞也是如此
这基本上是通过流式细胞实验得到的
红细胞上戳洞是ATP产生机制之一
但这只是解释了大约10分钟的ATP释放
而空化产生的血流增加持续时间比这些微孔产生的要长得多
所以一定有相关的机制包含其中
所以我们开始思考ATP是如何从细胞中出来的
它们不只是从微孔里溢出来
在平滑肌细胞和内皮细胞中存在着特异性的ATP通道
我们对Pannexin-1通路非常感兴趣，因为Pannexin-1通路是剪切力依赖的ATP通道
所以每当它们受到剪切力时
ATP就会释放，当然，当我们观察不同小鼠后肢空化后血流量的改变
其中包括Pannexin-1基因敲除后的小鼠
仅敲除内皮细胞Pannexin-1的小鼠
以及应用Trovoflox阻断Pannexin-1通道的小鼠
我们观察到了血流增加的抑制，但由于微泡的作用，血流增加的效果并没有完全消失
这证明了Pannexin-1在介导微泡空化引起的血流灌注增加方面发挥着重要作用
相关的支持数据有很多
如果你感兴趣可以
阅读我们两三年前在Circulation上发表的这篇文章
基本上这些数据都是用来帮助我们建立剪切力介导微泡空化释放ATP的模式
我们已经知道微泡空化可以从红细胞和内皮细胞中释放出ATP
有些事通过使细胞产生微孔洞
但有些则来自ATP通道
如Pannexin-1
从我刚才给你们看的论文和数据中，你们可以看一下
ATP有三种方式导致血管扩张
它直接通过P2Y受体结合导致NO和前列腺素释放，
它转化为腺苷并与A2B受体结合，同样导致NO和前列腺素释放，
也可以通过腺苷结合到A2A受体来降低平滑肌张力
所以微泡空化减小血管张力是一个非常复杂的过程
现在我们想弄清楚这是否可以用于治疗
在小鼠缺血模型中，我们发现它确实可以
我们看最上边一张图
这是正常的丰富的小鼠后肢使用最大强度投影成像
这是后肢的长轴视图
我们创建了一个模式使你可以看到肌肉缺血处理后的这个区域仅有低水平的血流灌注
这里显示的是这个方案中血液流量的减少与对照组相比
经过十分钟高功率超声波作用
可以看到以前没有血流的这个区域的组织血流量显著增加
但有趣的是
十分钟的超声空化效果
可以持续24到48小时
所以这不仅仅是微孔的作用
还有通道介导的ATP释放使得产生长时间的有益效果
我们最近发现这种情况也会发生在人类身上
这是我们在正常对照以及有外周动脉疾病患者的小腿上施加超声作用的一些数据
我们做了一些很简单的操作
我们只是在10分钟微泡高强度间歇超声前后对小腿肌肉的一小部分进行了低强度灌注成像
间歇超声波检查小腿循环中的气泡
我们发现组织血流量增加
这里单独在小腿使用了超声波
然而
我们在正常对照组中什么也没看到
这是超声暴露组和对侧小腿进行对照
第二天我们让这些病人和受试者回来 用微泡做了一次空化治疗
我们看到组织的血流量增加了两到三倍
不仅仅是在健康对照组中 甚至在外周动脉疾病患者中也是
我们甚至看到了对侧肢体的一点影响
这可能是由于系统性的ATP释放增加了组织灌注
这篇论文已经在今年早些时候发表了
我们想最大化这些效果,
我们研究了各种不同的变量
包括线的重叠线，线性重叠非常重要，因为你想让你的微泡暴露在很高的声压下
所以你不希望你的脉冲排列得很近
否则你可能在低于预定压力的情况下对微泡进行空化
但你也不能使它们间隔太大，以免错过某些微气泡
我们调整了线密度和脉冲持续时间
以及声功率、基线是为做三维空化做准备
事实上 我们发现叠加的声束可以靠得很近
不会因为有太多的线重叠而得到很多不好的效果
如果你使用三维而不是二维的超声 你会得到一点额外的流量增加
但这种优势并没有那么大
最后
我们想从骨骼肌和四肢延伸到其他组织
比如心脏
最近发表了一些相关的研究
其中最著名的来自巴西的威尔逊·马蒂亚斯和汤姆·波特。
他们对急性小鼠进行了较早的溶栓试验，发现在进行初次PCI之前和之后的微泡空化可以减少梗死面积。
现在他们尚不清楚它的机理
可能是因为它除了有助于溶解大血管的血栓
同时也可以在微循环中发挥一些有益的作用
包括通过降低微血管张力来增加微血管血流
因此 我们观察小鼠的心脏
看微泡的空化是否也会增加心肌的血流量
就像我们在肌肉中发现的一样
野生型小鼠由蓝色的线代表
可以看到血流量稳定增加
在5分钟持续升高
并一直持续到三十分钟甚至更久
这就是ATP释放的通道
我们通过Pannexin-1敲除的不通过通道释放ATP的小鼠确认的这一点
因为我们没有在这些小鼠看到
血液流动的迅速增加
仅通过细胞微孔释放ATP
是无法持续的
它会下降
就是ATP在两种小鼠释放的不同导致了这种差别
在Pannexin-1敲除小鼠中，心脏内的ATP释放并没有完全停止
但它明显减少了
我们在非人灵长类动物身上做了同样的实验
这是来自恒河猴的实验 在这些实验中
我们所做的是我们在四腔心切面中进行了8分钟的高机械指数空化
所以只有室间隔上部和侧壁暴露在高机械指数空化中
我们在两腔心切面观察了心肌的灌注，
我们看看空化后会发生什么
在远端组织的血液流动会有所增加
两腔心切面前壁和后壁没有暴露于空化中
这种作用是由腺苷产生的
显然，当空化时的流量增加至少等于血管扩张而得到的腺苷
最后
我想展示一些最新的数据, 是说应用高机械指数连续超声时，
没有微泡的话
也能产生类似的反应吗
我们开始对这个感兴趣了
因为现在有一根导管被用来治疗肺栓塞
这是一种放置在肺动脉的药物输送超声导管 人们已经注意到它可以改善肺血流动力学
即使它不能溶解肺动脉中的血凝块
所以我们用小鼠
我们把这种导管放置在肌肉上，接着成像
声学元件或者在肌肉上
或者仅仅在流入动脉上
然后我们观察血液流动、
ATP的释放和组织一氧化氮产量
在这些实验中，我们发现
直接放置在肌肉上的导管仅在上游动脉上产生血液流量增加两到三倍
增加微血管的
血容量和流速
OK,
远不及使用微泡时产生的效果
要知道
微气泡的空化使血流增加了7到8倍
多了两到三倍
但这些仍是有意义的血流量增加
我们知道这不仅仅来自ATP的释放
由这些导管引起的我们把导管挂在这里观察ATP的释放
但它也来自于肌肉中一氧化氮的直接释放
它是ATP的下游
但有趣的是 我们第一次发现超声波只能从红细胞中释放一氧化氮
体外实验显示红细胞没有释放导致了红细胞的释放
所以
在此基础上
我们得到以下结论
即流量增加是微泡空化的响应
微泡空化是直接在横纹肌循环中进行的，
并且这种流量的增加非常明显
在正常小鼠中是七到八倍
但也可用于治疗和逆转动脉缺血。
无微气泡的高占空比超声也能增加血流
但比较弱 这些影响不能只发生在你把超声波放在肌肉上
但它可以从大血管下游传导到远端微循环。
非常感谢
我很高兴能参加这次会议
B.